牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量測定步驟

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

12.2.5.6測定

(1)液相色譜測定條件

色譜柱： Kromasil 100-5C18，5 μm，150 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者；流動(dòng)相： 0.01 mol/L草酸溶液-乙腈～甲醇(77+18+5，v/v/v)； 流速： 1.0 mL/min；柱溫： 40℃； 檢測波長： 350 nm；進(jìn)樣量：60 μL。

(2)液相色譜測定

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的參考保留時(shí)間分別為3.09 min、3.73 min、8.27 min和12.53 min。土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖見圖12-11。

圖12-11 土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖

12.2.5.7 分析條件的選擇

(1)提取條件的選擇

四環(huán)素類抗生素分子含有若干親水的羥基，易溶于水和較低級的伯醇類，在中性和酸性溶液中較穩(wěn)定。在pH 3～8的范圍內(nèi)離子化，在pH3左右以陽離子形式存在，在pH 7.5以上時(shí)以陰離子形式存在?？膳c二價(jià)、三價(jià)金屬離子陽離子螯合。

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)和鈣，影響四環(huán)素抗生素的提取。采用了20%三氯乙酸、硫酸鋅-亞鐵氫化鉀體系、乙腈等作為蛋白沉淀劑，雖然蛋白沉淀效果較好，但回收率均較低。用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取，并在較低溫度下離心，可以起到沉淀蛋白的作用，并掩蔽二價(jià)陽離子Ca2+和Mg2+的干擾，可以獲得較為滿意的回收率，因此選用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液為提取液。

(2)凈化條件的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)中，對比了WCX、Oasis HLB單-固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱加羧酸型陽離子交換柱雙柱合用的效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WCX柱凈化效果不好且回收率低。單用Oasis HLB固相萃取柱凈化，也有較大的干擾峰存在，如圖12-12所示；而采用Oasis HLB和羧酸型陽離子交換柱雙柱凈化，凈化效果好，在待測物出峰處無干擾峰，見圖12-13。 在對HLB柱的洗脫條件上對比了乙酸乙酯、甲醇以及二者一定比例的溶液，見表12-28。 發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的提高，回收率會(huì)增加，說明甲醇的洗脫效果較好，當(dāng)甲醇比例達(dá)到50%時(shí)和純甲醇的洗脫效果相差不大，但是考慮到HLB的上樣液及淋洗液為水溶液，洗脫溶液有乙酸乙酯存在時(shí)，需要對柱體抽干很長時(shí)間，洗脫液才能順利的滴下，所以本方法選擇甲醇為HLB洗脫劑。通過試驗(yàn)，用5 mL即可達(dá)到完全洗脫的目的。

圖12-12 牛奶空白樣 品經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后色譜圖

圖 12-13 牛奶空白樣品經(jīng)HLB和Carboxylic Acid雙固相萃取柱凈化后色譜圖

表12-28 不同溶劑對HLB柱的洗脫效果

(3)色譜條件的優(yōu)化

使用Kromasil 100-5 C18 (150 mm×4.6 mm)液相色譜柱對土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的進(jìn)行分析，采用0.01 mol/L草酸溶液+乙腈+甲醇溶液(v/v/v)作為流動(dòng)相，用70+20+10，75+20+5，80+15+5，77+18+5 等不同比例的溶液進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)以77+18+5比例的流動(dòng)相可以使4種四環(huán)素族抗生素達(dá)到很好的分離，并且可以在較短時(shí)間內(nèi)出峰。因此選用此比例的溶液作為流動(dòng)相。

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