牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量測(cè)定步驟

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

9.2.4.6測(cè)定

(1)液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse SB-C8，3.5um，150mm×4.6mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(7+3，v/v)；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：50μL。

(2)質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧電離；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：350℃；霧化氣壓力：0.083MPa；氣簾氣壓力：0.1240MPa；輔助氣1壓力：0.2756MPa；輔助氣2壓力：0.2412MPa；噴霧器電流：-5μA；電噴霧電壓：-4500V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量和去簇電壓見表9-20。

表9-20 5種激素及代謝物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量和去簇電壓

9.2.4.7 分析條件的選擇

(1) 被測(cè)物的提取

牛奶成分復(fù)雜，除水分外還含有蛋白質(zhì)、脂肪和多種微量元素，樣品的提取是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。參照相關(guān)文獻(xiàn)考察了叔丁基甲醚、乙腈作為被測(cè)物提取劑對(duì)樣品處理結(jié)果的影響。研究表明，采用叔丁基甲醚作為提取溶液，提取中極易發(fā)生乳化現(xiàn)象，且回收率偏低。改用乙腈提取后，溶液未出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，并且回收率提高。因此本方法采用乙腈作為蛋白沉淀劑和提取劑。

(2) 固相萃取凈化

本方法首先選用了OasisHLB柱進(jìn)行凈化，但靈敏度較低，后改用美國(guó)Waters公司OasismAX柱(60mg)進(jìn)行SPE凈化處理后，靈敏度及回收率相對(duì)較高。本方法檢測(cè)的5種類雌激素及代謝物要求限量低，基質(zhì)復(fù)雜，因此考慮應(yīng)用自動(dòng)固相萃取儀(ASPE)減少人為因素誤差，提高重現(xiàn)性。對(duì)淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表9-21至表9-23。

表9-21 淋洗液比例對(duì)回收率的影響(淋洗液用量2mL)

表9-22 洗脫液比例對(duì)回收率的影響(先用1mL氨水-水[5+95]淋洗，0.5mL甲醇淋洗，再進(jìn)行洗脫)

表9-23 洗脫液用量對(duì)回收率的影響(分三次洗脫，每次用量3mL)

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的目標(biāo)物為兩類，玉米赤霉醇及代謝物和二苯乙烯類激素。兩類物質(zhì)性質(zhì)上存在差別，因而在確定最終實(shí)驗(yàn)條件時(shí)需兼顧兩類物質(zhì)。由表9-21可見，淋洗液比例選用氨水-水(5+95，v/v)，2mL，被測(cè)物基本.上沒有丟失。由表9-22實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，應(yīng)用甲酸-甲醇(5+95，v/v)洗脫液可得到全部目標(biāo)物較高的回收率。由表9-23實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，應(yīng)用6mL洗脫液能將待測(cè)物洗脫約90%，再增加洗脫液用量回收率沒有明顯提高，但吹干時(shí)間將延長(zhǎng)。最終確定了本實(shí)驗(yàn)淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項(xiàng)參數(shù)。

(3)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進(jìn)樣方式，以5μL/min將玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中。-級(jí)質(zhì)譜分析(Q1，母離子掃描)比較了電噴霧電離(ESI)的正方式和負(fù)方式，5種被測(cè)物均在負(fù)方式條件下得到了較高的響應(yīng)值，確定了準(zhǔn)分子離子峰[M-1]，優(yōu)化了去簇電壓(DP)。對(duì)被測(cè)物的準(zhǔn)分子離子碰撞后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(MS2，子離子掃描)，得到子離子質(zhì)譜圖，見圖9-3。對(duì)每種被測(cè)物選定的子離子進(jìn)行碰撞氣能量(CE)的優(yōu)化。在連接了液相色譜儀后，采用電噴霧電離(ESI)負(fù)方式進(jìn)行測(cè)定。通過對(duì)ESI(-)條件下離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣1壓力、輔助氣2壓力、噴霧器電流等參數(shù)優(yōu)化，確定了本方法最終分析參數(shù)。以優(yōu)化后本方法提供的參數(shù)對(duì)被測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和雙烯雌酚的方法檢出限為1.0μg/kg。

(4)HPLC條件的優(yōu)化

本方法先后試用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多個(gè)品牌的C18和C8柱，經(jīng)比較Agilent公司的ZORBAX SB C8(150mm×4.6mm，3.5μm)對(duì)玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素的分析柱效更好一些。采用ESI電離時(shí)，乙腈作為流動(dòng)相，流速0.5mL/min。在此前提下試驗(yàn)了不同流動(dòng)相比例和梯度程序。由于流速較高，乙腈比例不宜低，最終選定乙腈-水=70+30。對(duì)比了不同梯度洗脫程序的分離結(jié)果，沒有明顯改善，因而選定了固定比例流動(dòng)相。

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